Comment ça marche
L'efficacité PCR vous dit quelle fraction du maximum théorique d'amplification chaque cycle atteint réellement. Le maximum théorique est le doublement exact par cycle — efficacité 100 % signifie que chaque cycle multiplie le produit par exactement 2. La façon pratique de la mesurer est une courbe standard : préparez une série de dilutions 1:10 de votre matrice, faites tourner la qPCR sur chaque dilution, et tracez le Ct en fonction du log₁₀ de la concentration d'entrée. Les points devraient tomber sur une droite. La pente de cette droite est l'entrée de cette calculatrice.
La formule est E = 10^(−1/pente) − 1, avec E exprimée en fraction (multiplier par 100 pour le pourcentage). Le raisonnement est géométrique. Si l'amplification est parfaite, chaque chute d'un facteur 10 sur le matériel initial ajoute exactement log₂(10) = 3,322 cycles au Ct, parce que c'est le nombre de doublements nécessaires pour rattraper le facteur 10 manquant. Donc une qPCR « parfaite » a une pente de courbe standard de −3,322. Une pente plus raide (plus négative, ex. −3,6) signifie qu'il faut plus de 3,322 cycles pour amplifier une dilution 10×, donc une efficacité inférieure à 100 %. Une pente moins prononcée que −3,322 (ex. −3,0) impliquerait gagner plus vite que le doublement permet, ce qui est biologiquement impossible et signale inhibiteurs, dimères d'amorces ou contamination. La partie 10^(−1/pente) ne fait qu'inverser cette géométrie pour donner le multiplicateur par cycle.
La plage acceptable est 90-110 % d'efficacité, avec R² ≥ 0,98 sur les points de la courbe. En dessous de 90 %, la réaction peine — amorces sous-optimales, matrice trop diluée, inhibiteurs — et les Ct deviennent plus bruyants. Au-dessus de 110 % c'est presque toujours un artefact, le plus souvent des dimères d'amorces dans les puits sans matrice qui contaminent les hautes dilutions. Un R² sous 0,98 signifie que les points sortent de la droite, souvent parce que les dilutions n'ont pas été propres ou que le bout haut-dilution touche la limite de détection. Si vous comptez utiliser ΔΔCt en aval, les efficacités cible et référence devraient idéalement coïncider à environ 5 points près ; sinon, passez à la méthode de Pfaffl, qui injecte les efficacités réelles dans la formule.
La formule
La pente est celle de la droite Ct vs log₁₀(concentration d'entrée), ajustée sur au moins 4-5 points d'une dilution sérielle au 1/10. Elle sera toujours négative (le Ct baisse quand la concentration monte). E est l'efficacité en fraction ; multiplier par 100 pour le pourcentage. f est le facteur d'amplification par cycle : 2,000 signifie doublement parfait, 1,800 signifie que chaque cycle multiplie par 1,8. R² devrait être ≥ 0,98 pour que la courbe soit considérée bien ajustée ; la calculatrice accepte R² comme indicateur qualité mais ne l'utilise pas dans le calcul d'efficacité.
Exemple de calcul
- Vous faites une courbe standard de dilution sérielle 1/10, vous obtenez une pente de −3,32 et R² = 0,999.
- E = 10^(−1/−3,32) − 1 = 10^0,3012 − 1 = 2,001 − 1 = 1,001 ≈ 100 %.
- Facteur par cycle f = 2,001 — la réaction double par cycle comme prévu. Verdict : bonne. Sûr d'utiliser ΔΔCt.
Questions fréquentes
Quelle plage de pente est acceptable ?
Une pente d'exactement −3,322 correspond à 100 % d'efficacité. La plage acceptable est environ −3,10 à −3,60, ce qui donne des efficacités de 90-110 %. Au-delà, il faut diagnostiquer avant de faire confiance aux comparaisons de Ct en aval. Pente plus raide que −3,60 (ex. −3,8 ou −4,0) signifie efficacité sous 90 % — la réaction amplifie mal ; vérifiez le design des amorces, cherchez des inhibiteurs venus de la prep ARN, et demandez-vous si vos Ct les plus élevés sont trop dilués pour être dans le linéaire. Pente moins prononcée que −3,10 (ex. −2,9 ou −3,0) implique une efficacité apparente au-dessus de 110 %, biologiquement impossible ; presque toujours contamination par dimères d'amorces sur les puits hautement dilués, ou dérive de pipetage dans la série. Le R² doit aussi être ≥ 0,98 ; sinon, la pente elle-même n'est pas bien déterminée.
Combien de points de courbe standard faut-il utiliser ?
Au moins quatre, idéalement cinq, tous en triplicat technique. Cinq points couvrant cinq ordres de grandeur (ex. 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10¹ copies par réaction) donnent à la pente beaucoup de levier et permettent de repérer quelles dilutions, le cas échéant, sortent du linéaire. Avec trois points ou moins, l'estimation de la pente est assez bruitée pour que l'efficacité bouge de 10+ points de pourcentage juste à cause de la variabilité de pipetage. Les dilutions elles-mêmes comptent autant que le nombre — faites un stock mère de dilution unique, puis aliquotez frais à chaque fois plutôt que de rediluer depuis un stock de travail qui a subi plusieurs congélations/décongélations. Le point le plus dilué est le plus susceptible d'échouer ; si son triplicat s'étale sur plusieurs cycles, il est sous votre limite de quantification et il faut le retirer de la régression.
Mon efficacité est à 85 % — je continue quand même ?
Probablement pas pour du travail de qualité publication, et certainement pas pour des comparaisons ΔΔCt contre une référence d'efficacité nettement différente. 85 % signifie que chaque cycle multiplie par environ 1,85 au lieu de 2, ce qui composé sur 30+ cycles donne un biais systématique notable sur le fold change apparent. Deux pistes pratiques. (1) Diagnostiquer : redessiner les amorces (le correctif le plus courant — utilisez un outil de design avec appariement de Tm strict et contrôle de structures secondaires), chercher les inhibiteurs (une dilution 1/10 de votre échantillon devrait sortir avec un Ct exactement 3,32 cycles plus haut ; sinon, inhibiteurs présents), et vérifier que la série de dilutions n'a pas transporté de vieux tampon. (2) Si 85 % est ce que vous avez et qu'il faut avancer, passez de Livak ΔΔCt à Pfaffl, qui utilise l'efficacité mesurée réelle de chaque paire d'amorces. Pfaffl donne un fold change moins biaisé mais ne règle pas les problèmes de sensibilité — il faudra toujours plus de matrice de départ qu'avec un essai à 100 %.
Quel rapport entre efficacité PCR et fold change ΔΔCt ?
La formule de Livak 2^(−ΔΔCt) suppose que cible et référence amplifient à exactement 100 % d'efficacité — chaque cycle double le produit pour les deux. Quand les efficacités sont proches (disons cible 98 % et référence 102 %, toutes deux à ~5 points de 100 %), l'erreur introduite est assez petite pour que Livak ΔΔCt suffise dans la plupart des travaux exploratoires. Quand les efficacités diffèrent de façon notable (ex. cible 88 %, référence 105 %), la formule ΔΔCt simple n'est plus valable : la même différence de Ct ne correspond plus au même fold change pour les deux gènes. Le correctif est Pfaffl, qui généralise à ratio = (E_cible)^(−ΔCt_cible) / (E_réf)^(−ΔCt_réf), où les E sortent de cette calculatrice (un par paire d'amorces). En pratique, validez les efficacités pour chaque paire avant de faire confiance à un quelconque fold change qPCR, et soit appariez les efficacités (en améliorant la pire amorce), soit utilisez Pfaffl quand elles ne s'apparient pas.