Cómo funciona
La eficiencia de PCR te dice qué fracción del máximo teórico de amplificación está alcanzando cada ciclo. El máximo teórico es duplicación exacta por ciclo — eficiencia 100 % significa que cada ciclo multiplica el producto por 2 exactamente. La forma práctica de medirlo es una curva estándar: prepara diluciones seriadas 1:10 de tu plantilla, corre qPCR en cada dilución y representa el Ct frente al log₁₀ de la concentración de entrada. Los puntos deberían caer sobre una recta. Esa pendiente es la entrada de esta calculadora.
La fórmula es E = 10^(−1/pendiente) − 1, con E como fracción (multiplica por 100 para %). La justificación es geométrica. Si la amplificación es perfecta, cada caída de 10× en el material inicial añade exactamente log₂(10) = 3,322 ciclos al Ct, porque ese es el número de duplicaciones necesarias para compensar el factor 10 que falta. Por tanto, una qPCR «perfecta» tiene pendiente de curva estándar de −3,322. Una pendiente más empinada (más negativa, p. ej. −3,6) significa que necesitas más de 3,322 ciclos para amplificar la dilución 10×, es decir, eficiencia por debajo de 100 %. Una pendiente menos pronunciada que −3,322 (p. ej. −3,0) implica ganar más rápido que la duplicación, biológicamente imposible y señal de inhibidores, dímeros de cebador o contaminación. La parte 10^(−1/pendiente) solo invierte la geometría para darte el multiplicador por ciclo.
El rango aceptable es 90-110 % de eficiencia, con R² ≥ 0,98 en los puntos de la curva. Por debajo del 90 % la reacción está peleando — cebadores subóptimos, plantilla muy diluida, inhibidores — y los Ct salen más ruidosos. Por encima del 110 % suele ser un artefacto, lo más común dímeros de cebador en los pocillos sin plantilla que contaminan las diluciones altas. Un R² menor de 0,98 indica que los puntos individuales se salen de la recta, a menudo porque las diluciones no se hicieron limpias o el extremo más diluido pega con el límite de detección. Si vas a usar ΔΔCt aguas abajo, las eficiencias de diana y referencia deberían coincidir dentro de unos 5 puntos porcentuales; si no, cambia al método de Pfaffl, que mete las eficiencias reales en la fórmula.
La fórmula
La pendiente es la de la recta en una gráfica Ct vs log₁₀(concentración de entrada), ajustada sobre al menos 4-5 puntos de una serie de dilución 1:10. Siempre será negativa (el Ct baja al subir la concentración). E es la eficiencia como fracción; multiplica por 100 para porcentaje. f es el factor de amplificación por ciclo: 2,000 significa duplicación perfecta; 1,800 significa que cada ciclo multiplica por 1,8. El R² debería ser ≥ 0,98 para que la curva esté bien ajustada; la calculadora acepta R² como indicador de calidad pero no lo usa en el cálculo de eficiencia.
Ejemplo de cálculo
- Corres una curva estándar de dilución seriada 10×, obtienes una pendiente de −3,32 y R² = 0,999.
- E = 10^(−1/−3,32) − 1 = 10^0,3012 − 1 = 2,001 − 1 = 1,001 ≈ 100 %.
- Factor por ciclo f = 2,001 — la reacción duplica por ciclo como debería. Veredicto: buena. Seguro usar ΔΔCt.
Preguntas frecuentes
¿Qué rango de pendiente es aceptable?
Una pendiente de exactamente −3,322 corresponde a un 100 % de eficiencia. El rango aceptable es aproximadamente de −3,10 a −3,60, que se traduce en eficiencias del 90-110 %. Fuera de eso conviene depurar antes de confiar en comparaciones de Ct posteriores. Pendiente más empinada que −3,60 (p. ej. −3,8 o −4,0) significa eficiencia por debajo del 90 % — la reacción amplifica mal; revisa diseño de cebadores, busca inhibidores arrastrados de la extracción de ARN y plantéate si los puntos de Ct más alto están demasiado diluidos para estar en el rango lineal. Pendiente menos pronunciada que −3,10 (p. ej. −2,9 o −3,0) implica eficiencia aparente por encima del 110 %, biológicamente imposible; suele ser contaminación por dímeros de cebador en los pocillos de mayor dilución, o deriva de pipeteo en la serie. Además, el R² debe ser ≥ 0,98; si no, la propia pendiente no está bien determinada.
¿Cuántos puntos de curva estándar debería usar?
Al menos cuatro, idealmente cinco, todos en triplicado técnico. Cinco puntos cubriendo cinco órdenes de magnitud (p. ej. 10⁵, 10⁴, 10³, 10², 10¹ copias por reacción) da palanca de sobra a la pendiente y permite ver qué diluciones, si alguna, se salen del rango lineal. Con tres puntos o menos, la estimación de la pendiente queda lo bastante ruidosa como para que la eficiencia oscile 10+ puntos porcentuales solo por la variabilidad de pipeteo de las diluciones. Las diluciones en sí importan tanto como el número — haz un stock madre de dilución único y alícuota fresca cada vez, en vez de rediluir desde un stock de trabajo que ha sufrido múltiples congelados/descongelados. El punto más diluido es el que más probabilidad tiene de fallar; si ves que su triplicado se extiende a lo largo de varios ciclos, está por debajo de tu límite de cuantificación y conviene retirarlo de la regresión.
Mi eficiencia es del 85 % — ¿sigo adelante igual?
Probablemente no, ni para publicación de calidad ni para comparaciones ΔΔCt frente a un cebador de referencia con eficiencia muy distinta. Un 85 % significa que cada ciclo multiplica por 1,85 en vez de por 2, y compuesto sobre 30+ ciclos eso introduce un sesgo sistemático notable en el fold change aparente. Dos caminos prácticos. (1) Diagnostica: rediseña los cebadores (el arreglo más habitual — usa un diseñador con casado estricto de Tm y control de estructura secundaria), busca inhibidores (una dilución 1:10 de tu muestra debería correr con un Ct exactamente 3,32 ciclos mayor; si no, hay inhibidores) y verifica que la serie de diluciones no arrastra buffer viejo. (2) Si el 85 % es lo que tienes y has de seguir, cambia de Livak ΔΔCt a Pfaffl, que usa la eficiencia real medida de cada par de cebadores. Pfaffl da un fold change menos sesgado pero no arregla problemas de sensibilidad — seguirás necesitando más plantilla inicial que en un ensayo al 100 %.
¿Qué relación tiene la eficiencia con el fold change ΔΔCt?
La fórmula de Livak 2^(−ΔΔCt) asume que diana y referencia amplifican exactamente al 100 % — es decir, cada ciclo duplica el producto para ambos. Cuando las eficiencias están cerca (digamos diana 98 % y referencia 102 %, ambos dentro de ~5 puntos del 100 %), el error introducido es lo bastante pequeño como para que el ΔΔCt de Livak baste para la mayoría del trabajo exploratorio. Cuando las eficiencias difieren de forma relevante (p. ej. diana 88 %, referencia 105 %), la fórmula simple ΔΔCt deja de ser válida: la misma diferencia de Ct ya no corresponde al mismo fold change para ambos genes. La solución es Pfaffl, que generaliza a ratio = (E_diana)^(−ΔCt_diana) / (E_ref)^(−ΔCt_ref), con los E que sale de esta calculadora (uno por par de cebadores). En la práctica, valida las eficiencias de cada par antes de fiarte de cualquier fold change qPCR y, o bien empareja las eficiencias (mejorando el peor cebador), o bien usa Pfaffl cuando no encajen.